ADN/NCN/1/2021

Wykonanie analizy  metagenomiczną  próbek  DNA w  oparciu  o  masowe równoległe sekwencjonowanie:

•         regionu V3-V4 genu 16S rRNA umożliwiające identyfikację grup taksonomicznych zarówno Bacteria jak i Archea (300 próbek) z rozszerzoną analizą bioinformatyczna;

•         pełnych metagenomów w podejściu typu shotgun (36 próbek).

Szczegóły badania V3-V4 genu 16S rRNA:

1. Przygotowane bibliotek NGS metodą dwustopniowego PCR (amplifikacja regionów badanych z dołączeniem sekwencji adap torowy eh, indeksowanie).
2. Sekwencjonowanie z wykorzystaniem urządzenia MiSeq firmy Illumina w trybie sparowanych końców w dwóch odczytach po 300 zasad. Spodziewana minimalna liczba par odczytów na próbkę to 50 000.
3. Podstawowa analiza bioinformatyczna obejmująca filtrowanie odczytów, klasyfikację do poziomu gatunku w oparciu o bazę danych sekwencji referencyjnych SILVA oraz tabele procentowego udziału poszczególnych bakterii w próbce.
4. Rozszerzona analiza bioinformatyczna: analiza różnorodności alfa: wyznaczenie parametrów richness (na podstawie observed OTUs, chaol index, ACE) oraz diversity (na podstawie Shannon index, Simpson index) dla próbek, wizualizacja w postaci wykresów; analiza różnorodności beta: wyznaczenie parametrów podobieństwa między próbkami (na podstawie bray-curtis similarity index, morisita-horn similarity index), konstrukcja drzew podobieństwa gatunkowego UPGMA, analiza głównych składowych (PCA) i analiza głównych współrzędnych (PcoA), konstrukcja drzew filogenetycznych dla bakterii, graficzne przedstawienie wyników (wykresy słupowe lub kołowe). Porównanie max 2-3 grup eksperymantalnych przedstawione na jednym wykresie.

Szczegóły badania pełnych metagenomów typu shotgun:

Próbki DNA powinny być poddane mechanicznej  fragmentacji przy użyciu energii akustycznej  na urządzeniu Covaris 210x. Biblioteki NGS muszą być zsekwencjonowane na aparacie NovaSeq6000 (Illumina) w trybie PE150 z założeniem uzyskania minimum 40 min par odczytów na próbkę. Do analizy wyników sugerujemy platformę MG-RAST. Niezbędna będzie pomoc w załadowaniu danych oraz ustawieniu analizy. MG-RAST to darmowy, kompleksowy serwer do analizy danych metagenomowych, będący jednocześnie repozytorium udostępnionych publicznie projektów. Integruje on dane z różnych baz danych referencyjnych. Różnorodność taksonomiczna określana m.in. na podstawie baz GreenGenes, Silva, ITS czy RDR Z kolei analiza funkcjonalna genów występujących w środowisku opiera się na bazach takich jak COG, KEGG, NOG.

Wymagania dotyczące próbek:

metagenomika 16S

Rodzaj próbki: DNA metagenomowe (gDNA)

Ilość próbki: > 50 ng

Stężenie próbki: > 5-10 ng/ul

Objętość próbki: > 20 pi

Jakość próbki: próbka niezdegradowana, bez kontaminacji RNA i białkami

Czystość próbki: OD260/280 = 1,8 - 2,0

DNA zawieszone w wodzie lub lOmM Tris pH 7

metagenomika typu shotgun

Rodzaj próbki: DNA metagenomowe (gDNA)

Ilość próbki: > 500 ng

Stężenie próbki: > 5 ng/pl

Objętość próbki: > 20 pi

Jakość próbki: próbka niezdegradowana, bez kontaminacji RNA i białkami

Czystość próbki: OD260/280 = 1,8 - 2,0

DNA zawieszone w wodzie lub lOmM Tris pH 7